免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。
　　
　　直接法
　　
　　將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。
　　
　　間接法
　　
　　如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（*抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗原—抗體—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為*抗體，其它步驟的抗原檢查相同。
　　
　　標記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發生反應，因此，制備標記抗體適用于雞任何抗原的診斷。
　　
　　常用于免疫熒光組織化學染色的熒光素有：異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothioeyanate，TRITC)、四乙基羅丹明(tetraethylrhodamineB200，RB200)、得克薩斯紅(Texasred)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、花青類(cyanine，如Cy3、Cy5)等。此外還有一些新型熒光染料，如量子點。
　　
　　(1)異硫氰酸熒光素(FITC)：FITC性質穩定，易溶于水和乙醇，能與蛋白質結合，是檢測組織細胞內蛋白質zui常用的熒光探針。它還能標記抗體，可用于免疫組織化學單染或多重染色。缺點是在光照下易淬滅，易受自發熒光影響。zui大激發光波長為490nm；zui大發射光波長為525nm，呈現黃綠色熒光。
　　
　　(2)四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)：該熒光素能與細胞內蛋白質結合，比FITC穩定性好，在生理條件下對pH值變化不敏感，熒光強度受自發熒光干擾小。zui大激發光波長為550nm；zui大發射光波長為620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發出的黃綠色熒光對比鮮明，常用于免疫熒光組織化學雙重染色。
　　
　　(3)四乙基羅丹明(RB200)：能與細胞內蛋白質結合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性質穩定，可長期保存，廣泛應用于雙標記示蹤染色。zui大激發光波長為570nm，zui大發射光波長為595-600nm，呈橙紅色熒光。
　　
　　(4)花青類染料：常用的有Cy3、Cy5等，能與細胞內蛋白質結合。這類染料的熒光特性與傳統熒光素類似，但水溶性和對光穩定性較強，熒光量子產率較高，對pH等環境不敏感。常用于多重染色。Cy3zui大激發光波長為570nm，zui大發射光波長為650nm，呈綠色熒光。但是，在綠光光譜波長激發下，Cy3也可出現紅色熒光。Cy5的zui大激發光波長為649nm，zui大發射光波長為680nm，呈紅色熒光。由于Cy5的zui大發射波長為680nm，很難用裸眼觀察，而且不能使用高壓汞燈作為理想的激發光源，因此，使用普通熒光顯微鏡時，不推薦使用Cy5。通常觀察Cy5時需使用激光掃描共聚焦顯微鏡。
　　
　　(5)乙酸甲酯：其本身不發熒光，但透膜進入細胞質后，在酯酶的作用下轉變為具有熒光特性的乙酸甲酯。其激發光譜有pH依賴性，是使用zui多的細胞內pH熒光指示劑。zui大激發光波長為505nm，zui大發射光波長為530nm，呈綠色熒光。
　　
　　(6)Indo-1：是典型的雙發射熒光探針。無鈣時在485nm左右有發射峰，結合鈣后，則在405nm處有發射峰，兩者的比值與細胞內游離鈣離子濃度成線性關系，將此比值與標準曲線相比即可得出細胞內游離鈣濃度，因此，可利用此探針定量檢測細胞內游離鈣離子濃度。zui大激發光波長為330/346nm，zui大發射光波長為405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)熒光。
　　
　　(7)量子點(quantumdot)：是近年來研制的一種新型熒光染料，又稱半導體納米晶體(semiconductornanocrystal)，是由幾百或幾千個納米級顆粒構成的半導體材料，性質穩定，溶于水，細胞本身不能合成和組裝。量子點具有熒光時間長、產生多種顏色、檢測方便和應用范圍廣等優點。當某一波長的激發光對多種大小不同的量子點進行照射時，可以同時觀察到多種顏色，因而可同時進行多個目標的觀察和檢測。量子點可與抗體、鏈霉親和素等多種分子進行耦聯，檢測靶分子的分布和功能。